Xərçəng-beyin əlaqəsi immunitet müdafiəsini zəiflədir

Siçanlar və in vivo prosedurlar

ağciyərləri innervasiya edən sensor sinirlər - Xərçəng-beyin əlaqəsi immunitet müdafiəsini zəiflədir - Daha əvvəl təsvir edilmiş Kras^LSL−G12D/+; p53^fl/fl (KP) siçanları istifadə olunmuşdur. KP siçanları Rosa26^{LSL−tdTomato} siçanları ilə çarpazlaşdırılaraq KP; LSL-tdTomato siçanları əldə edilmişdir. Vəhşi tipli C57BL/6 J, Trpv1-cre, Rosa26^LSL−DTR (LSL-DTR), Vglut2-cre, Baf53b-cre, Pparγ^fl/fl və CD11c-cre siçanları The Jackson Laboratory-dən alınmışdır. Trpv1-cre və LSL-DTR siçanlarının çarpazlaşdırılması ilə Trpv1-cre; LSL-DTR siçanları yaradılmışdır. Npy2r-IRES-cre və P2ry1-IRES-cre siçanları əvvəlki tədqiqatlarda təsvir edilmişdir; onlar LSL-DTR siçanları ilə çarpazlaşdırılaraq müvafiq olaraq Npy2r-IRES-cre; LSL-DTR və P2ry1-IRES-cre; LSL-DTR siçanları əldə edilmişdir. Trpv1-DTR siçanlarının dondurulmuş spermaları M. Hoon (National Institute of Dental and Craniofacial Research) tərəfindən təmin edilmişdir; bərpa edilmiş Trpv1-DTR siçanları KP siçanları ilə çarpazlaşdırılaraq KP; Trpv1-DTR siçanları yaradılmışdır. BATF3-nokaut siçanları M. Haldar tərəfindən, ADRB2-nokaut siçanları isə S. Thomas tərəfindən təqdim edilmişdir; sonuncular Trpv1-cre; LSL-DTR siçanları ilə çarpazlaşdırılaraq Trpv1-cre; LSL-DTR; Adrb2^−/− siçanları əldə edilmişdir.

Avtoxton modeldə şiş induksiyası üçün KP siçanlarına intratraxeal yolla 2.5 × 10⁸ lövhə əmələ gətirən vahid Ad5mSPC-Cre virusu (Viral Vector Core, University of Iowa) yeridilmişdir. Toxumalar şişin yaranmasından 12-16 həftə sonra toplanmışdır. Ortotopik transplantasiya modelində isə quyruq venasına 1.5 × 10⁵ KP hüceyrəsi venadaxili yeridilmişdir. KP hüceyrə xətti, KP siçanlarında avtoxton yaranan ağciyər şişlərindən əldə edilmiş və aşağı pasajda saxlanmışdır; onlar 37°C-də 5% CO₂ şəraitində fetal mal-qara zərdabı (FBS, 10%; Gibco), L-qlütamin (2 mM; Gibco), Penisilin-Streptomisin (50 U/mL; Gibco) əlavə edilmiş DMEM mühitində (Corning) kultivasiya edilmişdir. İnyeksiyadan əvvəl hüceyrələr Hank's balanslaşdırılmış duz məhlulu (HBSS) ilə 3 dəfə yuyulmuş və endotoksinsiz HBSS-də 1.5 × 10⁶ hüceyrə/mL sıxlığında resuspensiya edilmişdir. Bütün təcrübələrdə istifadədən əvvəl hüceyrələrdə mikoplazma olmadığı təsdiqlənmişdir.

Sümük iliyi ximera təcrübələri üçün Npy2r-IRES-cre; LSL-DTR və ya Trpv1-cre; LSL-DTR siçanları Gammacell-40 Irradiator ilə letal dozada şüalandırılmış (5.5 Gy x 2, 3.5 saat aralıqla) və sonra donor siçanlardan alınan 4-8 milyon sümük iliyi hüceyrəsi retro-orbital yolla yeridilmişdir. İki həftə ərzində Sulfatrim (Pharmaceutical Associates, Inc) tərkibli su verilmiş və həftədə iki dəfə dəyişdirilmişdir. Normal mikrobiotanı bərpa etmək üçün sulfatrimli suyun kəsilməsindən sonra 4 həftə müddətində şüalanmamış siçanların nəcis qranulları ximerik siçanlara köçürülmüşdür. Qarışıq sümük iliyi ximera təcrübələrində, vəhşi tipli CD45.1 donorlarından və ya Adrb2^−/− donorlarından alınan sümük iliyi hüceyrələri CD11c-cre; Pparg^fl/fl donorlarının hüceyrələri ilə 1:1 nisbətində qarışdırılmış və yuxarıda təsvir olunduğu kimi resipiyent siçanlara yeridilmişdir. Şiş induksiyası sümük iliyinin bərpasından 7 həftə sonra aparılmışdır. Bütün təcrübələrdə bərpa effektivliyinin konjenik markerlər vasitəsilə 95%-dən yuxarı olduğu təsdiqlənmişdir.

VSN-lərin DT vasitəsilə ablasiyası üçün vaqal nodoz qanqlionları anesteziya altında cərrahi yolla açılmışdır. Boyunun ventral səthi boyunca kəsik aparılmış və küt disseksiya tətbiq edilmişdir. Nodoz/yarem kompleksinə 120 nL fosfat-buferli salin (PBS) məhlulunda 20 nq DT (Sigma-Aldrich) və 0.05% Fast Green (Sigma-Aldrich) olan mikropipetka daxil edilmişdir. DT məhlulu Nanoject II injektoru (Drummond Scientific Company) ilə yeridilmişdir. Proses bədənin digər tərəfindəki VNG üçün təkrarlanmışdır. Cərrahi yaralar CP Medical Sutures (661B, CP Medical) ilə bağlanmışdır. Əməliyyatdan sonrakı qulluq kimi dərialtı davamlı təsirli Meloksikam tətbiq edilmişdir. Siçanlar sonrakı eksperimental prosedurlar üçün 2-3 həftə sağalmağa buraxılmışdır.

Trpv1⁺ VSN-lərin kimyəvi denervasiyası üçün VNG-lər yuxarıda təsvir edildiyi kimi cərrahi yolla açılmışdır. Hər siçana hər qanqliona 25 nq RTX (Santa Cruz) və ya daşıyıcı (PBS) ilə birlikdə 0.05% Fast Green yeridilmişdir. İnyeksiya bədənin digər tərəfindəki VNG üçün təkrarlanmışdır. Siçanların sonrakı eksperimental prosedurlar üçün 3-4 həftə sağalmasına icazə verilmişdir.

Ağciyər şişlərində VSN-lərin anteroqrad izlənməsi üçün VNG-lər yuxarıda göstərildiyi kimi cərrahi yolla açılmışdır. Nodoz/yarem kompleksinə AAV-flex-tdTomato (Addgene 28306-AAV9) və ya AAV-eGFP (UNC AV5221) ilə 0.05% Fast Green FCF (Sigma-Aldrich) olan mikropipetka daxil edilmişdir. Proses bədənin digər tərəfindəki VNG üçün təkrarlanmışdır. Siçanlar sonrakı eksperimental prosedurlar üçün əməliyyatdan sonra 2 həftə sağalmağa buraxılmışdır. Ağciyəri innervasiya edən hissi sinirlərin retroqrad izlənməsi üçün şişli siçanların ağciyərlərinə 45 μl PBS ilə qarışdırılmış 5 μl AAVretro-hSyn-flex-mCherry (Addgene 50459-AAVrg) intratraxeal yolla yeridilmişdir.

RVLM neyronlarının xemogenetik manipulyasiyası üçün RVLM-ə breqmaya nisbətən anterior-posterior -6.35, medial-lateral ±1.35, dorsal-ventral -6.3 koordinatlarında 200 nl AAV2/9-syn-DIO-hM4Di-mcherry və ya AAV2/9-CAG-Flex-GFP (Boston Children’s Hospital Viral Core) yeridilmişdir. Əməliyyat sonrası qulluq kimi dərialtı davamlı təsirli Meloksikam təmin edilmişdir. Siçanlar təcrübələrə başlamazdan əvvəl stereotaksik cərrahiyyədən sonra sağalmağa buraxılmışdır; beyində az və ya heç bir reporter ifadəsi olmayan, texniki problemləri göstərən siçanlar təhlillərdən çıxarılmışdır. CNO (Fisher Scientific, A3317-50) şiş inokulyasiyası ilə eyni gündən başlayaraq gündə iki dəfə periton daxilinə (1 mg/kg) yeridilmişdir.

Ağciyəri innervasiya edən VSN-lərin xemogenetik susdurulması üçün siçanlara 45 μl PBS ilə qarışdırılmış 5 μl AAVretro-hSyn-flex-mCherry (Addgene 50459-AAVrg) və ya AAVretro-hSyn-flex-hM4Di-mCherry (Addgene 44362-AAVrg) intratraxeal yolla yeridilmişdir. CNO, şiş inokulyasiyasından 5 gün sonra başlayaraq təcrübənin sonuna qədər gündə iki dəfə intraperitoneal olaraq (1 mg/kg) yeridilmişdir. Sağlam siçanlarda ağciyəri innervasiya edən VSN-lərin xemogenetik aktivləşdirilməsi üçün 45 μl PBS ilə qarışdırılmış 5 μl AAVretro-hSyn-flex-mCherry (Addgene 50459-AAVrg) və ya AAVretro-hSyn-flex-hM3Dq-mCherry (Addgene 44361-AAVrg) intratraxeal yolla yeridilmişdir. Toxuma toplanmasından 90 dəqiqə əvvəl bir doza CNO intraperitoneal olaraq (1 mg/kg) yeridilmişdir.

Sistemik CGRP blokadası üçün BIBN4096 (Tocris) gündəlik 2 mg/kg dozada intraperitoneal olaraq yeridilmişdir; ağciyərdə yerli CGRP blokadası üçün BIBN4096 (Tocris) hər iki gündən bir hər siçana 3 µg dozada intratraxeal yolla yeridilmişdir. Müalicə şiş inokulyasiyasından bir həftə sonra və ya iki gün əvvəl başlamış və təcrübənin sonuna qədər davam etmişdir.

Aerozollaşdırılmış salbutamol müalicəsi üçün salbutamol sulfat (Selleck Chemicals) steril salin məhlulunda 5 mg/ml konsentrasiyada həll edilmişdir. Siçanlar PRONEB Max Aerozol Çatdırılma Sisteminə (PARI Respiratory Equipment) qoşulmuş aerozol kamerasına yerləşdirilmiş və gündəlik 45 dəqiqə salbutamol məhlulu ilə müalicə olunmuşdur. Nəzarət qrupundakı siçanlar aerozollaşdırılmış salin ilə müalicə edilmişdir. Müalicə şiş inokulyasiyasından 1 gün sonra başlamış və təcrübənin sonuna qədər davam etmişdir.

Alveolyar makrofaqların tükənməsi üçün siçanlara şiş inokulyasiyasından 1 gün əvvəl başlayaraq hər üç gündən bir təcrübənin sonuna qədər 50 μl klodronat liposomları və ya nəzarət (Liposoma) intratraxeal yolla yeridilmişdir.

Antikor vasitəli T hüceyrə tükənməsi üçün anti-CD4 (GK1.5, BioXCell), anti-CD8 (2.43, BioXCell) və ya onların müvafiq izotip nəzarətləri həftədə iki dəfə hər siçana 200 μg dozada intraperitoneal olaraq yeridilmişdir. Antikor inyeksiyası şiş inokulyasiyasından bir həftə sonra başlamış və təcrübənin sonuna qədər davam etmişdir.

Tədqiqatlarda 6-24 həftəlik həm erkək, həm də dişi siçanlardan istifadə edilmişdir; cins və yaşa uyğun siçanlar təsadüfi olaraq müxtəlif müalicə qruplarına təyin edilmişdir. Ağciyər şişi təcrübələrində siçanlar xəstəlik əlamətləri göstərdikdə və ya IACUC təlimatlarına uyğun evtanaziya meyarlarına cavab verdikdə evtanaziya edilmişdir. Siçan təcrübələrinin heç birində limitlər aşılmamışdır. Bu siçan modelləri xüsusi patojensiz şəraitdə, temperaturu (21-24 °C) və rütubəti (30-70%) idarə olunan, 12:12 saatlıq işıq:qaranlıq dövrü ilə təmin edilən və standart gəmirici pəhrizi ilə qidalanan mühitdə saxlanılmışdır. Bütün heyvanların saxlanması və prosedurları Pennsylvania Universiteti, Yale Universiteti və ya St Jude Uşaq Araşdırma Xəstəxanasının Heyvanlara Qayğı və İstifadə Komitəsi və İnstitusional Biotəhlükəsizlik Komitəsinin tələblərinə uyğun olaraq həyata keçirilmişdir.

Axın sitometriyası və FACS çeşidləməsi

Dövriyyədəki immun hüceyrələrini təhlildən kənarlaşdırmaq üçün evtanaziyadan 2 dəqiqə əvvəl siçanlara retro-orbital yolla PE-CF594 konjuqasiyalı anti-CD45 antikoru (30-F11, BD Bioscience) yeridilmişdir. Ağciyərlər toplanmış, gentleMACS dissosiator sistemi (Miltenyibiotec) ilə parçalanmış və 37°C-də, 100 rpm sürətlə 30 dəqiqə ərzində 125 U/ml Kollagenaza IV (Worthington Biochemical) və 100 U/ml DNaz I (Roche) ilə həzm edilmişdir. Həzm olunmuş ağciyər toxuması daha sonra 100 μm-lik hüceyrə süzgəcindən keçirilmişdir. Limfa düyünü nümunələri əzilmiş və 70 μm-lik hüceyrə süzgəcindən keçirilmişdir. Qırmızı qan hüceyrələri ammonium xlorid-kalium bikarbonat (ACK) lizis buferi ilə lizis edilmişdir. FcR-in Fc blok reagenti (2.4G2, 1:200, BD Bioscience) ilə bloklanmasından sonra tək hüceyrəli suspenziyalar müxtəlif antikorlarla boyanmışdır. Tədqiqat zamanı çox sayda spesifik antikorlardan istifadə olunmuşdur: LIVE/DEAD Fixable Blue boyası, Alexa Fluor 532-I-A/I-E, APC/Cy7-I-A/I-E, BUV395-CD45.1 və digərləri. Hüceyrədaxili sitokinlərin boyanması üçün hüceyrələr səth boyanmasından əvvəl 37°C-də 4 saat ərzində Hüceyrə Stimulyasiya Kokteyli (eBioscience) və Zülal Nəqliyyat İnhibitor Kokteyli (eBioscience) ilə əvvəlcədən inkubasiya edilmişdir. Transkripsiya faktorunun boyanması Foxp3 Fiksasiya/Permeabilizasiya Dəstindən (eBioscience) istifadə edilərək aparılmışdır.

Axın sitometriyası Cytek Aurora (Cytek Bioscience) cihazında həyata keçirilmiş, məlumatlar isə SpectroFlow (v.3.0.3, Cytek) və FlowJo (v.10.5.3, Treestar) proqram təminatı ilə təhlil edilmişdir. Çeşidləmə üçün siçan ağciyər toxumaları yuxarıda təsvir edildiyi kimi həzm edilmişdir. Parçalanmış ağciyər toxuması 100 μm-lik hüceyrə süzgəcindən keçirilmiş və tək hüceyrəli suspenziyalar çeşidləmədən əvvəl 30 dəqiqə buz üzərində səth antikorları ilə boyanmışdır. Ölü hüceyrələr Zombie NIR fiksasiya olunan boya ilə boyanmışdır. FACS çeşidləməsi Cytek Aurora CS (Cytek Bioscience) cihazında aparılmış və çeşidlənmiş hüceyrələr sonrakı RNT analizlərinə cəlb edilmişdir.

Alveolyar makrofaqların kulturası

Siçan sümük iliyi hüceyrələri Dulbecco'nun Modifikasiya Edilmiş Eagle Mühitində (DMEM, Corning) kultivasiya edilmiş və alveolyar makrofaqlara bənzər hüceyrələrə differensiasiya edilmişdir. Mühitə 10% istiliklə inaktivləşdirilmiş fetal mal-qara zərdabı (FBS, Gibco), penisilin/streptomisin (Gibco), L-qlütamin (Gibco), siçan TGFβ (Peprotech, 2 ng/ml) və siçan GM-CSF (Peprotech, 20 ng/ml) əlavə edilmiş və kultivasiya 9 gün davam etmişdir. Differensiasiya olunmuş alveolyar makrofaqlar yalnız 10 μM noradrenalin (Sigma-Aldrich) ilə və ya avtoxton KP şişlərindən hazırlanmış TES ilə birlikdə müalicə edilmişdir. Hüceyrələr Dulbecco'nun PBS (DPBS) məhlulu ilə yuyulmuş və RNT ekstraksiyası üçün stimulyasiyadan 6 saat sonra toplanmışdır.

VSN kulturası

Siçan VNG-ləri disseksiya edilmiş və əvvəlcə HEPES buferli salin məhlulunda (Sigma) 1 μg/μl kollagenaza P (Roche) ilə 37°C-də 21 dəqiqə inkubasiya edilərək parçalanmışdır. Sonra onlar 37°C-də 10 dəqiqə 0.25% tripsin (Gibco) ilə parçalanmış və FBS əlavəli DMEM mühiti ilə neytrallaşdırılmışdır. Hüceyrə suspenziyalarındakı neyronlar ölçüsü azalan pipetkalarla triturasiya edilmiş, sonra isə lamininlə (114956-81-9, Sigma) örtülmüş örtük şüşələrinə hər şüşəyə 1 × 10³ hüceyrə hesabı ilə əkilmişdir. Hüceyrələr LES, TCM və ya TES ilə müalicədən 36-40 saat sonra təhlil edilmişdir.

TES, RPMI mühitində 37°C-də 2 mg/ml kollagenaza Tip IV (Worthington Biochemical) və 40 U/ml Dnaza I (Roche) ilə həzm edilmiş və doğranmış ağciyər şişlərindən hazırlanmışdır. Həzm olunmuş toxuma daha sonra 70 μm-lik tor süzgəcdən keçirilmişdir. Hüceyrələr 10⁷ hüceyrə/ml konsentrasiyasında resuspensiya edilmiş və 24 quyulu plastinada Hepes, penisilin-streptomisin və istiliklə inaktivləşdirilmiş FBS ilə zənginləşdirilmiş 1 ml tam mühitdə bir gecə kultivasiya edilmişdir. Hüceyrə supernatanti ertəsi gün toplanmış və 350 g-də sentrifuqadan keçirilmişdir. LES üçün eyni prosedurlar sağlam ağciyər toxuması ilə aparılmışdır. TCM üçün KP şiş hüceyrə xətti 80% konfluentliyə çatana qədər kultivasiya edilmişdir. Hüceyrələr tripsinləşdirilmiş, PBS ilə yuyulmuş, sadə OptiMEM (ThermoFisher) ilə 7 × 10⁵ hüceyrə/ml konsentrasiyasında resuspensiya edilmiş və 10 sm-lik petri qabına 10 ml həcmdə əkilmişdir. Hüceyrə supernatanti 24 saat sonra toplanmış, 350 g-də sentrifuqadan keçirilmiş və 0.22 μm-lik filtrdən süzülmüşdür.

VSN və şiş hüceyrələrinin birgə kulturası üçün VSN-lər 96 quyulu plastinada KP şiş hüceyrələri ilə birlikdə lamininlə örtülmüş örtük şüşələrinə əkilmiş və hüceyrələr əkildikdən 36-40 saat sonra təhlil edilmişdir. NGF-nokaut şiş hüceyrələri, KP hüceyrə xəttini NGF-i hədəfləyən CAS9 və sgRNA (GATCAGAGTGTAGAACAACATGG) ifadə edən lentivirusla transduksiya etməklə yaradılmışdır. Rosa26 lokusunu hədəfləyən sgRNA (GAAGATGGGCGGGAGTCTTC) ilə transduksiya edilmiş KP şiş hüceyrələri nəzarət (sgCtrl) kimi istifadə edilmişdir. Effektiv NGF delesiyası anti-NGF antikoru (Alomone Labs, AN-240) ilə Western blot analizi vasitəsilə təsdiqlənmişdir.

Hər VSN kultura təcrübəsi üçün 6-8 siçanın nodoz qanqlion neyronları birləşdirilmiş və hər müalicə üçün üç texniki təkrarla əkilmişdir. Kultivasiya edilmiş VSN-lərdən neyrit böyüməsini təhlil etmək üçün hüceyrələr fiksasiya edilmiş və TUBB3 üçün boyanmışdır. İmmunoflüoresan şəkillər Leica SP8 flüoresan mikroskopu ilə əldə edilmişdir. Kəmiyyət təhlili üçün hər şəraitdən təsadüfi olaraq minimum altı görüntü sahəsi seçilmiş (hər təkrar üçün ən azı iki görüntü sahəsi) və bu sahələrdəki bütün neyronlar analiz edilmişdir. Hər VSN üçün neyrit uzunluğu təsdiqlənmiş ImageJ tracer SNT makrosu (Fiji, v.2.9.0) ilə ölçülmüşdür və bütün şəkil əldə etmə və təhlil prosesi ikiqat kor üsulla aparılmışdır.

Şiş hüceyrələrinin noradrenalin ilə təsiri

KP şiş hüceyrələri dondurulmuş ehtiyatdan bərpa edilmiş və istifadədən əvvəl 1 həftə ərzində pasaj edilmişdir. Hər 24 saatdan bir KP şiş hüceyrələrinə 10 μM noradrenalin əlavə edilmişdir. Yapışan hüceyrələr 3 gündən sonra toplanmış və hüceyrə sayı hemositometrə əsaslanan sayma ilə müəyyən edilmişdir.

Ağciyər toxumasının histologiyası və immunoflüoresan boyanması

Siçan ağciyərləri bir gecə 4% paraformaldehiddə (PFA; Sigma) fiksasiya edilmiş və parafinə yerləşdirilmişdir. H&E boyanması Pennsylvania Universitetinin Penn Vet Müqayisəli Patologiya Mərkəzi tərəfindən aparılmışdır. H&E boyanmış slaydlar Aperio ScanScope AT2 sistemi istifadə edilərək Aperio Console DX (v.102.0.4.46) ilə 20x böyütmədə rəqəmsal olaraq skan edilmişdir və şiş yükü ilə şiş dərəcəsi skan edilmiş şəkillərdən kor üsulla kəmiyyətcə qiymətləndirilmişdir. Şiş yükü, QuPath proqram təminatı (https://qupath.github.io/) istifadə edilərək şiş sahəsinin ümumi ağciyər toxuması sahəsinə faiz nisbətini hesablamaqla qiymətləndirilmişdir; hər siçan üçün bütün beş pay təhlil edilmişdir.

İmmunoflüoresan boyanma üçün FFPE ağciyərlərinin 5 μm qalınlığında kəsikləri qurudulmuş, ksilol (Sigma) ilə deparafinləşdirilmiş və azalan dərəcəli spirt seriyaları ilə rehidratasiya edilmişdir. Antigenin bərpası təzyiqli qazanda 1 mM EDTA buferi (pH 8.0) istifadə edilərək aparılmışdır. Bloklamadan sonra slaydlar anti-ARG1 monoklonal antikoru (93668, 1:250, Cell Signaling Technology) və ya anti-CD8a monoklonal antikoru (4SM15, 1:250, Invitrogen) ilə boyanmışdır. Şəkillər ZEN3.1 (mavi nəşr) proqramı ilə ZEISS Axioscan 7 cihazında əldə edilmişdir.

Beyin toxumasının immunoflüoresan boyanması

Siçan beyin nümunələri bir gecə 4% PFA-da (Sigma) fiksasiya edilmiş, saxaroza ilə dehidratasiya olunmuş və OCT birləşməsinə (23-730-571, Fisher Scientific) yerləşdirilmişdir. Krio-kəsiklər 0.1% Triton X-100 ilə permeabilizasiya edilmiş, boyanmış və DAPI ilə Fluoromount-G (00-4959-52, Invitrogen) ilə bağlanmışdır. İmmunoflüoresan boyanma üçün istifadə olunan antikorlara anti-TH (AB1542, 1:500, Abcam) və anti-cFOS (2250, 1:300, Cell Signaling Technology) daxildir. Şəkillər LAS X (5.3.0) proqramı ilə Leica Stellaris 8 cihazında çəkilmişdir.

Qanqlionların immunoflüoresan boyanması

Siçan vaqal nodoz qanqlionları, DRG və ya T3-5 simpatik qanqlionları bir gecə 4% PFA-da (Sigma) fiksasiya edilmiş, saxaroza ilə dehidratasiya olunmuş və OCT birləşməsinə (23-730-571, Fisher Scientific) yerləşdirilmişdir. Krio-kəsiklər 0.1% Triton X-100 ilə permeabilizasiya edilmiş, boyanmış və DAPI ilə Fluoromount-G (00-4959-52, Invitrogen) ilə bağlanmışdır. İmmunoflüoresan boyanma üçün istifadə olunan antikorlara anti-TUBB3 (ab190575, 1:1,000, Abcam), anti-HB-EGF (AF-259-NA, 1:800, R&D system, DTR-i aşkar etmək üçün), anti-TRPV1 (ACC-030, 1:1,000, Alomone Labs) və anti-cFOS (ab222699, 1:1,000, Abcam) daxildir. Şəkillər LAS X (5.3.0) proqramı ilə Leica Stellaris 8 cihazında əldə edilmişdir.

RNAscope in situ hibridləşdirmə, görüntüləmə və kəmiyyət təhlili

RNAscope Multiplex Fluorescent v.2 analizləri (Advanced Cell Diagnostics) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq aparılmışdır. Siçanlar təzə hazırlanmış 4% PFA ilə transkardial perfuziya edilmişdir. Beyinlər 10-20-30% saxaroza qradientində krioproteksiyadan əvvəl 4°C-də 24 saat 4% PFA-da post-fiksasiya edilmişdir. RVLM-i ehtiva edən koronal kəsiklər (10 µm) kriostatda (Leica) -20°C-də kəsilmiş və birbaşa şüşə slaydlar üzərinə qoyulmuşdur. Kəsiklər hidrogen peroksid müalicəsi, hədəf bərpası və Proteaz III inkubasiyası daxil olmaqla proteaz əsaslı RNAscope protokolu ilə əvvəlcədən işlənmişdir. Prob hibridləşməsi Mm-Fos (316921-C1) və Mm-Slc17a6 (319171-C3) probları ilə aparılmış, sonra Opal 520 və Opal 650 (Akoya Biosciences) ilə nişanlanmışdır. Slaydlar motorlu stolu, PMT və HyD SP detektorları, dörd lazer xətti (405, 488, 552 və 638 nm) və 10×/0.4 Plan Apo obyektivi olan Leica SP8 konfokal mikroskopunda görüntülənmişdir. Təzə dondurulmuş vaqal nodoz qanqlion kəsikləri üçün Mm-Trpv1 (313331-C1) və Mm-Npy2r (315951-C2) probları istifadə edilmiş və müvafiq olaraq Opal 520 və Opal 690 ilə nişanlanmışdır.

Bütöv toxumanın şəffaflaşdırılması və immunoflüoresan boyanması

BAF53b⁺ və ya VGLUT2⁺ sinir liflərini və ya VSN-ləri vizuallaşdırmaq üçün siçan ağciyər toxuması əvvəllər təsvir edildiyi kimi CUBIC protokolu ilə şəffaflaşdırılmış və anti-RFP (1:200, Rockland) və anti-GFP (1:200, Aves labs) antikorları ilə boyanmışdır. Boyanmış ağciyər toxuması xüsusi bir kamera vasitəsilə təxminən 1 mm qalınlığa qədər bərabər şəkildə sıxılmışdır. Üçölçülü şəkillər Imaris (v.10.1, Oxford Instruments) ilə təxminən 500 μm qalınlıqda 5 μm z-addımlarla əldə edilmiş və kəmiyyət təhlili üçün FIJI proqramına idxal edilmişdir. Həlledici zülalların və peptid liqandlarının in vivo şəraitdə ümumiyyətlə 100-250 µm parakrin diapazonunda təsir etdiyini nəzərə alaraq, "şişlə əlaqəli" lifləri təyin etmək üçün 100 µm sərhəd kimi istifadə edilmişdir. Çox kiçik lezionların həddindən artıq qiymətləndirilməsinin qarşısını almaq üçün adaptiv bir qayda tətbiq edilmişdir: diametri <100 µm olan şiş düyünləri üçün yalnız şişin radiusuna (D/2) bərabər məsafədə olan liflər sayılır; daha böyük şişlər üçün 100 µm limiti saxlanılır. Şiş bölgələrindən 100 μm məsafədə və ya 100 μm radiuslu təsadüfi seçilmiş şişsiz alveol bölgələrindəki sinir liflərinin sayı kəmiyyətcə qiymətləndirilmişdir.

TH⁺ və VAChT⁺ sinir liflərini vizuallaşdırmaq üçün siçan ağciyər toxuması əvvəllər təsvir edildiyi kimi iDISCO protokolu ilə şəffaflaşdırılmış və anti-RFP (1:250, Rockland), anti-TH (1:250, Abcam) və anti-VAChT (1:250, Synaptic Systems) antikorları ilə boyanmışdır. Şəkillər Imaris ilə təxminən 1.5 mm qalınlıqda 2 μm z-addımlarla əldə edilmişdir. Şişlərdən 100 μm məsafədə olan TH⁺ sinirlərinin sayı hər bir fərdi şiş üçün kəmiyyətcə qiymətləndirilmiş və hər siçandakı hər şişə düşən TH⁺ sinir liflərinin orta sayı hesablanmışdır.

Təmizləmə ilə gücləndirilmiş 3D multipleks həcmli görüntüləmə

Siçan ağciyərləri PBS məhlulunda seyreltilmiş (1:4) BD CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences, 554714) ilə 4°C-də 1 gün fiksasiya edilmişdir. Fiksasiyadan sonra bütün toxumalar PBS-də qısa müddət (hər yuma 5 dəqiqə) yuyulmuş və OCT birləşməsinə (Sakura Finetek, 4583) yerləşdirilmədən əvvəl 4°C-də 1 gün 30% saxarozada inkubasiya edilmişdir. Dondurulmuş nümunələr CM1950 kriostatında (Leica Biosystems) 300 μm qalınlığında kəsilmişdir. Nümunələr 24 quyulu plastinada OCT-ni təmizləmək üçün nəmləndirilmiş və PBS ilə yuyulmuşdur. Nümunələr 1% siçan Fc bloku (BD Bioscience, 553142) olan BD Perm/Wash Buferində (BD Bioscience) ən azı 12 saat inkubasiya edilmiş və otaq temperaturunda çalkalayıcıda 24 saat ərzində 1% Fc bloku olan BD Perm/Wash Buferində (BD Bioscience, 554723) titrlənmiş antikorlarla boyanmışdır. İstifadə edilən antikorlara CD11c, MHC-II, TUBB3, CD3, CD45 və CD103 daxildir. Boyanmış nümunələr BD Perm/Wash Buferi ilə otaq temperaturunda çalkalayıcıda ən azı 20 dəqiqə olmaqla 3 dəfə yuyulmuş, 1% PFA ilə 10 dəqiqə fiksasiya edilmiş və sonra 20 dəqiqə PBS ilə yuyulmuşdur. Nümunələr 2 silikon izolyatoru (Grace Bio-Labs, 664407) olan bir slayd üzərinə köçürülmüş və kimyəvi tüstü başlığı altında 200 μl Ce3D mühiti ilə işlənmiş və bir gecə çalkalayıcıda otaq temperaturunda inkubasiya edilmişdir. Köhnə Ce3D çıxarıldıqdan sonra təmizlənmiş nümunələr 40 μl yeni Ce3D ilə montaj edilmiş və 2 SecureSeal Görüntüləmə Aralığı (654002, Grace Bio-Labs) ilə bir örtük şüşəsi ilə möhürlənmişdir. Görüntülər 20× yağ obyektivi, 3 HyD X və 2 HyD S detektoru və 440-790 nm arasında davamlı spektral çıxış verən ağ işıq lazeri və 405 nm lazeri olan tərs Leica Stellaris 8 konfokal mikroskopunda əldə edilmişdir. Şəkillər 300 μm qalınlığında 3 μm z-addımlarla əldə edilmişdir. Şəkillər Imaris File Converter (Oxford Instruments) ilə .ims fayllarına çevrilmişdir. Imaris-in Kanal Arithmetics funksiyası spektral yayılma və avtoflüoresansı aradan qaldırmaq üçün istifadə edilmişdir. Səs-küyü azaltmaq üçün Gaussian filtrləri tətbiq edilmişdir.

Noradrenalin ölçülməsi

Siçan ağciyər toxuması Tissuelyzer (Qiagen) istifadə edilərək 1 M perxlor turşusunda homogenləşdirilmişdir. Homogenat 20,000 g-də 5 dəqiqə sentrifuqadan keçirilmiş və supernatant təmiz bir boruya köçürülmüşdür. Supernatant daha sonra yarım həcm 2 M KOH/200 mM MOPS ilə neytrallaşdırılmış və KClO4 çöküntülərini aradan qaldırmaq üçün 20,000 g-də 5 dəqiqə sentrifuqadan keçirilmişdir. Supernatant HPLC/ECD sistemi (HPLC, Agilent 1260 Infinity II Quaternary System; Sütun: Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm 10 × 100 mm; ECD, Antec DECADE Elite; Elektrokimyəvi axın hüceyrəsi, Antec SenCell) ilə təhlil edilmişdir. Mobil faza 100 mM sirkə turşusu, 20 mM limon turşusu, 0.2 mM EDTA, 7.5% metanol, 2 mM NaCl, 500 mg/l natrium oktil sulfat, pH 4.86-dan ibarət idi. Axın hüceyrəsinin iş potensialı 0.5 V-də təyin edilmişdir.

ƏT-PZR

Ümumi RNT TRIzol (Invitrogen) istifadə edilərək təcrid edilmişdir. cDNT-lər daha sonra istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Superscript II (Invitrogen) və təsadüfi praymerlər istifadə edilərək əks transkripsiya edilmişdir. Kəmiyyətli PZR (qPCR) SYBR green (Bio-Rad Laboratories) istifadə edilərək aparılmışdır. Məlumatlar ViiA 7 Real-Time PCR sistemində (ThermoFisher Scientific) toplanmış və təhlil edilmişdir. Nümunələri normallaşdırmaq üçün Gapdh evdarlıq geni istifadə edilmişdir. Tədqiqatda Gapdh, Arg1, Adrb1, və Adrb2 genləri üçün xüsusi praymerlərdən istifadə olunmuşdur.

Tək hüceyrəli RNT-seq və onun təhlili

Yeddi sağlam və yeddi şişli siçandan (yaş və cinsə uyğun, şişli siçanlar üçün şiş inokulyasiyasından üç həftə sonra) həm sol, həm də sağ vaqal nodoz qanqlionları toplanmışdır. VSN-lər əvvəllər təsvir edildiyi kimi təcrid edilmiş və zənginləşdirilmişdir. Təxminən 5,000-10,000 VSN, Chromium Next GEM Chip G-nin (10X Genomics) hər kanalına yüklənmişdir. Tək hüceyrəli cDNT kitabxanaları Yale Genom Təhlili Mərkəzində (YCGA) hazırlanmış və Illumina NovaSeq S4 sekvenserində sekvensiya edilmişdir. RNT ifadəsi üçün xam sekvensiya məlumatları mm10 referans siçan transkriptomuna uyğunlaşdırılmışdır. Aşağı keyfiyyətli hüceyrələr süzülmüş və qalan hüceyrələr əvvəllər təsvir edildiyi kimi R paketi Seurat v.3 istifadə edilərək qruplaşdırılmışdır. Sağlam qrupdan 9,015 və şişli qrupdan 13,073 hüceyrə sekvensiya edilmişdir. VSN-lər Phox2b ifadəsinə görə müəyyən edilmişdir. Ağciyəri innervasiya edən VSN-lər Kcng1 ifadəsi və əvvəllər xarakterizə edilmiş ağciyəri innervasiya edən VSN populyasiyalarından etiket transferi ilə müəyyən edilmişdir. Etiket transferi Seurat-da (v.5.0.2) FindTransferAnchors funksiyası ilə referans və sorğu məlumat dəstləri arasında lövbərləri müəyyən etmək, ardınca isə TransferData ilə referans "seurat_cluster" etiketlərinə əsaslanaraq hüceyrə kimliklərini təyin etmək üçün aparılmışdır. DEG-lər Wilcoxon ranq-cəm testi ilə FindMarkers funksiyası istifadə edilərək müəyyən edilmişdir. Genlər tənzimlənmiş P < 0.05, |log2(qat dəyişikliyi)| > 1 və hüceyrələrin ən azı 10%-də ifadə olunma meyarlarına cavab verdikdə əhəmiyyətli dərəcədə fərqli ifadə olunmuş hesab edilmişdir.

Klinik məlumatların təhlili

Sağqalma təhlili üçün 518 LUAD xəstəsinin RNT-seq gen ifadə profilləri və əlaqəli klinik məlumatları TCGA-dan (https://portal.gdc.cancer.gov/) əldə edilmişdir. VSN və simpatik sinir siqnal genlərinin kombinasiyası insan gen simvollarına (Ensembl) çevrilmiş və fərdi TCGA şiş ifadə profillərini tək nümunəli Gen Dəsti Zənginləşdirmə Təhlili (ssGSEA) vasitəsilə qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir. Median ssGSEA ballarına əsaslanaraq, xəstələr yüksək (ilk 50%) və aşağı (son 50%) ballı qruplara ayrılmışdır. Bu qruplar arasında sağqalma nəticələrini müqayisə etmək üçün Kaplan-Meier sağqalma əyriləri yaradılmış və statistik əhəmiyyətlilik loq-ranq testi ilə qiymətləndirilmişdir. Bütün sağqalma təhlilləri R-də (v.3.6-4) "survival" paketi istifadə edilərək aparılmışdır. LUAD xəstələrində birləşmiş VSN-simpatik siqnal genlərinin və CD8 T hüceyrələri ilə əlaqəli genlərin ifadəsi arasındakı əlaqə ssGSEA ballarına əsaslanan Pearson korrelyasiyası ilə təhlil edilmişdir. VSN-Aşağı, simpatik-Aşağı və VSN-Yüksək, simpatik-Yüksək xəstə qrupları arasında CD8 siqnalını müqayisə etmək üçün müəyyən edilmiş CD8 gen dəsti istifadə edilərək hər xəstəyə ssGSEA tətbiq edilmişdir. İki xəstə qrupu arasında ssGSEA ballarındakı fərqi qiymətləndirmək üçün Wilcoxon ranq-cəm testi aparılmışdır.

Statistika

Bütün statistik təhlillər GraphPad Prism proqramının 10-cu versiyası (GraphPad Software) ilə aparılmışdır. Nəticələr başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə orta ± standart xəta (s.e.m.) kimi ifadə edilmişdir. İki qrupun müqayisəsi üçün cütləşdirilməmiş iki tərəfli Student t-testi, çox qrupun müqayisəsi üçün isə Tukey post hoc testi ilə bir tərəfli ANOVA istifadə edilmişdir. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001, NS əhəmiyyətsiz deməkdir. Dəqiq nümunə ölçüləri (n), istifadə olunan statistik testlər və dəqiq P dəyərləri şəkil alt yazılarında bildirilmişdir. Şəkil 5e-g-də göstərilən statistik müqayisələr üçün dəqiq P dəyərləri aşağıdakı kimidir. Şəkil 5e: ağciyər şiş yükü şiş/toxuma sahəsi kimi qiymətləndirilmişdir (G1 vs G2: P = 0.0001; G3 vs G4: P = 0.9080; G1 vs G3: P = 0.0027; G2 vs G4: P = 0.8884) və ümumi ağciyər kütləsi (G1 vs G2: P < 0.0001; G3 vs G4: P = 0.4029; G1 vs G3: P = 0.0009; G2 vs G4: P = 0.8149). Şəkil 5f, ARG1⁺ alveolyar makrofaqlar üçün, G1 vs G2: P = 0.0013, G3 vs G4: P = 0.9264, G1 vs G3: P = 0.0066, G2 vs G4: P = 0.9958. Şəkil 5g, CD8 T hüceyrələri üçün, G1 vs G2: P = 0.0116, G3 vs G4: P = 0.4425, G1 vs G3: P = 0.0319, G2 vs G4: P = 0.8297; CD4 T hüceyrələri üçün, G1 vs G2: P = 0.0002, G3 vs G4: P = 0.9996, G1 vs G3: P = 0.0006, G2 vs G4: P = 0.8650.

Hesabat xülasəsi

Tədqiqatın dizaynı haqqında əlavə məlumat bu məqaləyə əlavə edilmiş Nature Portfolio Hesabat Xülasəsi sənədində mövcuddur. İstifadə olunan bütün siçan modelləri və eksperimental prosedurlar burada detallı təsvir edilmişdir.

24 saat